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動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒
本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，提取組織和細(xì)胞的基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司*新型材料，能夠高效、專一吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。提取的基因組DNA段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用本試劑盒提取的基因組DNA可用于各種常規(guī)操作，包括酶切、 PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。
操作步驟：
使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無水乙醇，加入休積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
1、樣品的處理：
a、細(xì)胞：取1×106-1×107個(gè)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，12000rpm離心1min收集細(xì)胞，貼壁細(xì)胞先用胰蛋白酶消化處理，再用預(yù)冷的PBS吹打成細(xì)胞懸液，然后12000rpm離心1min收集細(xì)胞，盡量除去上清，加200ul溶液A，振蕩*混勻。
b、組織：組織量不宜過大，一般不要超過25mg，可以使用勻漿器勻漿，好用液氮研磨成粉末狀，再用預(yù)冷的PBS或無菌水充分懸浮，然后12000rpm離心1min收集細(xì)胞，盡量除去上清，加200ul溶液A，振蕩*混勻。
2、向懸浮液中加入20ul (10mg/ml) 的RNase A，55℃放置15min。
3、加入20ul ( 10mg /ml ) 的蛋白酶K，充分顛倒混勻，55℃水浴消化，細(xì)胞消化時(shí)間較短，組織消化時(shí)間較長，一般需要1-3個(gè)小時(shí)才能完成（鼠尾需要消化）。消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直樣品消化*為止。消化*的指標(biāo)是：液體清亮及粘稠。
4、加入200ul體積溶液B，充分顛倒混勻，如出現(xiàn)白色沉淀，可放置于75℃ 15-30min，沉淀即會(huì)消失，不影
響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說明樣品消化不*，可能導(dǎo)致提取的DNA量少及不純，還有可能導(dǎo)致堵塞吸附柱。
5、加入200ul無水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中。
6、12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇)， 12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
9、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。
10、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心2min。
11、可將離心所得洗脫液再加入吸附柱中，12000rpm離心2min，即可得到高質(zhì)量的基因組DNA。
注意事項(xiàng):
1、試劑盒拆封后，RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。
2、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取的DNA段較小且提取量也下降。
3、如果試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響效果。
4、洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過小會(huì)影響回收效率:洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)，pH 值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。
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