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脂肪酸合成酶(FAS)活性檢測(cè)試劑盒

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為 1:5-10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000rpm，4℃離心 40min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10 4個(gè)）：提取液體積（mL）為 500-1000:1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3 分鐘）；然后 16000rpm，4℃離心 40min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、FAS 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑四置于 40℃水浴中預(yù)熱 30 min 以上。

3. 空白管：在 500μLEP 管中依次加入 20μL 蒸餾水、4μL 試劑二、4μL 試劑三、164μL 試劑四和 8μL 試劑五，迅速混勻后于 340nm 處測(cè)定吸光值，記錄第 30s 和 90s 時(shí)吸光值，分別記錄為 A1 和 A2?！鰽 空=A1-A2。

4. 測(cè)定管：在 500μLEP 管中依次加入 20μL 上清液、4μL 試劑二、4μL 試劑三、164μL 試劑四和 8μL 試劑五，迅速混勻后于 340nm 處測(cè)定吸光值，記錄第 30s 和 90s 時(shí)吸光值，分別記錄為 A1 和 A2?！鰽 測(cè)=A3-A4。

脂肪酸合成酶(FAS)活性檢測(cè)試劑盒

FAS 活性計(jì)算：使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1μmol NADPH 為 1U。 FAS(U/mg prot) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10 6] ÷(Cpr×V 樣)÷T=1.61×(△A 測(cè)定管 –△A 空白管) ÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化 1μmol NADPH 為 1U。 FAS(U/g) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10 6] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=1.61×(△A 測(cè)定管 –△A 空白管) ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：37℃中每 10 4個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1μmol NADPH 為 1U。 FAS(U/10 4 cell ) =[(△A 測(cè) 定 管 –△A 空 白 管 )÷ε÷d×V 反 總 ×10 6] ÷( 細(xì) 胞 數(shù) 量 ×V 樣 ÷V 樣總)÷T=1.61×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量 ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積， 200μL=2×10 -4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1μmol NADPH 為 1U。 FAS(U/mg prot) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10 6] ÷(Cpr×V 樣)÷T=3.22×(△A 測(cè)定管 –△A 空白管) ÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化 1μmol NADPH 為 1U。 FAS(U/g) =[(△A 測(cè)定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10 6] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=3.22×(△A 測(cè)定管 –△A 空白管) ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：37℃中每 10 4個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1μmol NADPH 為 1U。 FAS(U/10 4 cell ) =[(△A 測(cè) 定 管 –△A 空 白 管 )÷ε÷d×V 反 總 ×10 6] ÷( 細(xì) 胞 數(shù) 量 ×V 樣 ÷V 樣總)÷T=3.22×(△A 測(cè)定管–△A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量 ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積， 200μL=2×10 -4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

脂肪酸合成酶(FAS)活性檢測(cè)試劑盒

試劑一：液體×1 瓶，－20℃保存。用前 1 d 取出置于 4℃充分解凍后混勻。試劑二：粉劑×1 瓶。臨用前加入 440 μL 試劑四，充分溶解。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 440 μL 試劑四，充分溶解。試劑四：液體×1 瓶, 4℃保存。試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 840μL 試劑四，充分溶解。