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Solarbio 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒

Solarbio 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒

注意事項(xiàng)

A． 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過程中應(yīng)在18℃-25℃避光保存，啟封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

B． 待分離的樣本要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一定在20℃水浴

箱中復(fù)溫20 分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果好，且所有操作

過程一定要在無菌條件下進(jìn)行。

C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時(shí)間，摸索佳的分離條件（具體分離條件

各實(shí)驗(yàn)室自定）。D． 好使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

E． 分離過程中所用其他試劑如：hydroxyethyl starch550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及

紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為優(yōu)選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無菌、無病毒、無支原體、

低內(nèi)毒素水平且無細(xì)胞毒性，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。

4. 應(yīng) 用

適用于從各種動(dòng)物脾臟中分離淋巴細(xì)胞。

5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5EU/ml

無菌 直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每50ml溶液中含10μm以上的不溶性微粒20粒以下，

含25μm以上的不溶性微粒5粒以下

6. 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，有效期一周。

注：若保證無微生物污染，啟封后可置4℃長(zhǎng)期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易

出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

A． 試劑

脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒所含試劑、胎牛血清

B． 器材

玻璃離心管、玻璃滴管

水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、無菌工作臺(tái)

8. 各種動(dòng)物脾臟淋巴細(xì)胞分離液使用方法說明及圖例

取 1ml 脾臟細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×108-1×109個(gè)/ml，制備方法詳見“9、脾臟組織

單細(xì)胞懸液的制備方法”）小心疊加在C 液之液面上（比例為1：1），20℃±2℃，400g（約

1500 轉(zhuǎn)/分），離心20 分鐘（半徑15cm 水平轉(zhuǎn)子）。此時(shí)離心管中由上下細(xì)胞分四層。*層;為稀釋液層。第二層；為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含細(xì)胞洗滌液4-5 毫升的試管中，充分混勻后，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心20 分鐘。沉淀經(jīng)反復(fù)洗滌2 次即得所需淋巴細(xì)胞

注： 提取率大于80%。

9. 脾臟組織單細(xì)胞懸液的制備

注： A. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境。

B．本試劑盒中不包含膠原酶，若采用酶消化法制備單細(xì)胞懸液，請(qǐng)用戶根據(jù)各實(shí)驗(yàn)

室要求另購不同類型膠原酶。

Ⅰ. 剪碎法：將組織塊放入平皿后，加入少量 F液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪勻

漿狀，加入5mlF 液及20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用100 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過

濾到試管內(nèi)；離心沉淀1500 轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞洗滌液清洗3 次，每次以500rpm 短時(shí)

低速離心除去細(xì)胞碎片，以200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整

細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或

全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×108-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

 Ⅱ. 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入2mlF 液及20%胎

牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨勻漿；用5mlF 液及20%胎牛血清沖洗研器；收集細(xì)胞懸液，

經(jīng)200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；離心沉淀800rpm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液洗3 次，離

心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×108-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

Ⅲ. 酶消化法：

A． 用F 液將膠原酶稀釋，終濃度為400 U/ml，于冰浴備用。

B． 取一適當(dāng)大小培養(yǎng)皿進(jìn)行操作：用鑷子夾碎動(dòng)物脾臟，加入稀釋后的膠原酶，37℃消化20 分鐘。

C． 以100 或200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾，離心沉淀800prm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液

洗3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×108-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

計(jì)數(shù)與計(jì)算過程

1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，

對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)

胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm

2或>500 個(gè)/10 mm2時(shí)，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。C． 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)

胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。

E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：

A． 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時(shí)的量太多，使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。