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產品名稱:鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)

產品型號:P2010-Solarbio

產品報價:

產品特點:鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)
Ni-NTA是用于純化6xHis標簽重組蛋白的一種純化介質,它是由4%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得

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P2010-Solarbio鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)的詳細資料:

鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)

 

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標簽重組蛋白的一種純化介質,它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統(tǒng)表達的6×His標簽重組蛋白。NTA,含有四個螯合區(qū),較一般的三齒螯合劑能更好的結合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合,從而使His標簽蛋白結合在Ni-NTA純化介質上,未結合的蛋白被洗滌下去,結合在介質上的蛋白經過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來,從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質與His標簽蛋白具有*的親和力,可達5-20 mg/ml。可在非變性和變性條件下純化任何表達系統(tǒng)所得的His標簽蛋白。純化程序簡單,所得的蛋白純度可高達95%。Ni-NTA可再生4-6次,重復使用。本產品懸浮液為20%乙醇,已螯合Ni2+。

操作方法:

A. 非變性條件下抽提His標簽蛋白

1) 準備細胞,接種,誘導表達。收集細胞,置于-70°C或立即進行步驟2操作。

2) 加入1/20細胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細胞懸浮起來,加入溶菌酶,混勻,冰上放置30分鐘,超聲或勻漿破碎細胞。該步驟冰上操作。

4) 加入10% Triton X-100, 使終濃度為0.05%,充分混勻,冰上放置15分鐘。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上),4°C離心15分鐘以上。取上清,置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱,層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加NTA層析柱中,流速在15 ml/h左右,收集穿透部分,用SDS/PAGE分析蛋白的結合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗,流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫,流速控制在15 ml/h左右,收集洗脫液,每管收集一個NTA體積。

10) 確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質測定試劑盒,快速確定蛋白質的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白質的分布。

11)純化的目標蛋白質的保存條件需要根據蛋白質的性質和用途確定。 NTA-0 、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標簽蛋白

1) 準備細胞,接種,誘導表達。收集細胞,置于-70°C或立即進行步驟2操作。

2) 加入1/20細胞生長體積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細胞懸浮起來,冰上超聲破碎細胞,降低粘稠度。

4) 室溫放置30分鐘,間或混勻或用磁力攪拌。

5) 12000轉/分(20,000×g以上),4°C離心15分鐘以上。取上清,置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱,層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析柱中,流速控制在15 ml/h左右,收集穿透部分,用于SDS/PAGE分析蛋白質的結合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗,流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-40,GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫,流速在15 ml/ h左右,收集洗脫液,每管收集一個NTA體積。

10) 確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質測定試劑盒,快速確定蛋白質的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白質的分布。

11) 目標蛋白質需要進一步純化需要根據蛋白質的用途確定。

12) 純化的目標蛋白質需要復性,復性常用的手段可以參考有關手冊確定的原則。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA樹脂的再生

NTA樹脂在使用若干次數(shù)(3-5次)后,結合效率有所下降,可以用以下方法再生,提高樹脂的使用壽命和蛋白質的結合效率。

NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液,估計出NTA的樹脂體積,按下列次序將再生試劑加到層析柱里,在等上一步再生溶液流干后,再加下一步再生溶解。

用戶需要自行準備25%、50%、75%、100%(v/v)乙醇和去離子水。 從層析柱下端流干所有溶液,用2倍NTA樹脂體積的Stripping Solution I、2倍體積的去離子水、3倍體積的Stripping Solution II、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇、5倍體積的100%乙醇、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的去離子水、5倍體積的Stripping Solution III、3倍體積的去離子水分別洗一遍。

如果立即使用,用5倍體積的Ni Charging Solution洗,再用10倍體積的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗;如果想長期儲存,加入1倍體積的20%乙醇,4°C保存,使用前用5倍體積的Ni Charging Solution洗,再用10倍體積的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗

再生溶液配方:Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)

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